免疫组织化学ppt下载

这是免疫组织化学ppt，包括了免疫组织化学概况，免疫组化实验步骤和试剂，常见问题及处理方法，多色标记等内容，欢迎点击下载。

免疫组织化学ppt是由红软PPT免费下载网推荐的一款课件PPT类型的PowerPoint.

免疫组织/细胞化学 IHC/ICC 主要内容 免疫组织化学概况 免疫组化实验步骤和试剂 常见问题及处理方法 多色标记 免疫组织/细胞学简介 免疫组织学 是一种把分子水平的物质在组织原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应进行定性、定位测定，准确具体表达出来的一种方法。这些分子水平的物质可能与癌细胞、蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等等有关 技术平台 免疫组织学方法分类 酶免疫组织化学染色（IHC） IHC-Fr：冰冻切片 IHC-P：石蜡切片 荧光免疫组织染色（IF） 多用于冰冻组织切片或者细胞爬片 胶体金免疫组织染色（GIHC） 根据标本类型分类 石蜡切片：用酶免疫组织染色 冰冻切片：多用荧光免疫染色 细胞爬片：多用荧光免疫染色 免疫组化相关名称 酶免疫组织化学（IHC）常用方法 S-P/LAB方法 基本原理 S-P/LAB方法:一个亲和素和多个标记酶（HRP）结合，多个生物素与抗体（一抗或二抗）结合，细胞的抗原（或一抗）先与生物素化的抗体结合，既而将酶标记的亲和素结合在生物素上，最后进行显色反应定位。 ABC方法 基本原理 ABC法：先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成ABC复合物，抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，形成巨大复合物（网络大量酶分子），最后显色。 二抗直接偶联酶的Polymer 基本原理 Envision两步法：抗原与抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚化合物酶复合物（EnVision复合物），与第一抗体结合，进而由酶作用底物进行显色定位。 荧光免疫组织染色方法 使用荧光标记抗体，直接定位、定性检测组织或细胞蛋白表达情况。较免疫组化具有灵敏度高、操作简单的优点。 缺点是染色组织片不能长期保存 IF常用荧光素 FITC：绿色，激发波长488nm；发射波长515nm Rhodamine：橙色，激发波长570nm；发射波长570-590nm Texas Red：红色，激发波长589nm；发射波长570-615nm Cy3：橙色，激发波长512/550nm；发射波长570nm Cy5：红色，激发波长625/650nm；发射波长670nm 免疫组化实验注意事项 正确选配抗体 一抗必须是说明书上经过验证(tested application)可以用于IHC(IHC-P;IHC-Fr)检测的 二抗必须是和一抗来源及亚型相配套的 正确设置合适的对照 正确选配固定方法和修复方法 正确选配显色系统 免疫组化实验对照设置 阳性对照：判断染色全过程和所有试剂的正确性： A、内部对照：对照组织本身明确存在的抗原（二抗系统的正确性） B、外部对照：明确表达待测抗原的组织或细胞（一抗的工作性） 阴性对照：明确不表达待测抗原的组织或细胞 二抗对照：不加一抗，余操作相同 免疫组化基本操作步骤及需要的试剂 免疫组化基本操作步骤 Envision二步法操作步骤 1、组织切片60℃预热 2、常规脱蜡入水（二甲苯、各级酒精、水） 3、抗原修复 4、PBS/T洗3次，5min/次 5、3%H2O2 RT 10min（封闭内源HRP） 6、PBS/T洗3次，5min/次 7、10%正常山羊血清RT 30min（阻断组织内源IgG、Fc-R） 8、一抗4 ℃孵育过夜 9、PBS/T洗3次，5min/次 10、二抗RT 30min 11、PBS/T洗3次，5min/次 12、DAB显色，显微镜下观察，控制显色程度 13、充分水洗 14、苏木素复染核 15、1%盐酸酒精分化 16、充分水洗返蓝 17、脱水、透明，中性树胶封片 1、载玻片处理 重酪酸钾浓硫酸浸泡24h－ddH2O漂洗—95%乙醇浸泡12h 防脱粘片剂处理： Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent 可直接购买处理好的载玻片 2、组织固定 3、抗原修复 加热修复技术 修复方法：微波加热修复、高压热修复、煮沸热修复： 常用buffer：柠檬酸Buffer:0.01M， pH6.0 EDTA buffer: pH9.0 非加热修复技术 胃蛋白酶(细胞内抗原): 0.4%，37℃，30mins 胰酶(细胞间抗原): 0.05-0.25%，37℃，10-15mins Proteinase K : 20ug/ml 4、封闭 正常血清(5-10%)：阻断组织内源IgG、Fc-R BSA (5%) ：阻断组织内源IgG、Fc-R 特殊封闭试剂：当使用小鼠源性抗体检测小鼠组织抗原时 内源性生物素/亲和素：有些组织如肾脏、肝脏、脾脏含有很高的内源性生物素，如使用SP或者ABC试剂盒需要进行封闭 封闭条件：室温 30-120mins 如是HRP系统，则同时需要使用3% H2O2室温10-30mins淬灭内源性HRP的活性 5、一抗孵育 选择验证过待测种属和实验方法的一抗 根据说明书上推荐的固定和修复方法处理标本 说明书推荐的稀释比例仅作参考，需要根据标本类型来摸索最佳稀释比例 一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如PBS(T) /TBS(T)中4℃过夜 6、二抗及酶标记物孵育 根据一抗的来源和Ig亚型选择合适的二抗 根据说明书推荐的稀释比例和标本类型摸索最佳稀释比例 一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如PBS(T) /TBS(T)中室温(RT) 30-60mins 也可以选择商业化的试剂盒：SP，ABC或者两步法 7、显色 8、复染 9、脱水/透明/封片 10、结果观察 普通光学显微镜 荧光显微镜 IHC/ICC常见问题分析 常见问题及处理方法 组织脱片 非特异性背景染色 染色弱 无阳性染色 载玻片处理不充分 组织固定、脱水、透明不充分 组织切片太厚（>5um) 组织切片有折叠 过度的热抗原修复（高压、微波、水煮） 抗原修复液的pH值偏高 操作过程中冲洗方法不正确 封闭不充分：增加封闭试剂浓度、延长封闭时间 冲洗不充分：短时间多次数的洗涤更有效 实验过程中切片干燥：试剂量充足，注意观察，避免干片 组织切片折叠 组织抗原弥散：组织标本及时固定，选择合适的固定液 抗原修复不充分：更改修复方法，优化时间 内源性生物素/亲和素：使用封闭试剂或者不用SP/ABC系统 二抗原因：选择Fab段的抗体或者吸附过的抗体，设置二抗对照 一抗原因： 抗体浓度过高：降低抗体浓度、建议4℃过夜 选择纯化的抗体 设置阳性对照 试剂污染：重新配置新的缓冲液和试剂 组织固定、包埋时抗原被破坏 抗原位于细胞内，未使用破膜剂(尤其是定位于细胞核) 抗体浓度过低，孵育时间过短 操作中滴加试剂时缓冲液未漓干，致使试剂稀释 室内温度<15 ℃ 过度封闭 试剂超过有效期 抗体保存不当导致活性降低 染色过程中未避光（荧光染色） 操作错误（漏加试剂） 组织中无抗原 固定、包埋、修复时抗原被破坏 修复方法不当 一抗与二抗不匹配 底物和酶不匹配 封闭过度 封片剂选择不当 一种或多种试剂活性降低或失活 抗原位于细胞内，未使用破膜剂 多标记检测 多标记染色法 适用于同一组织片2~3个不同抗原的检测 技术平台： 同样的酶，不同底物 不同的酶，不同底物 荧光检测 适用于中性福尔马林固定的石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片 多色检测操作程序 多色标记抗体选择 一抗最好是不同动物来源的 选择验证过实验种属和方法的抗体 根据染色顺序选配合适的酶和底物 dopamine D1 receptor 免疫组化 人肾脏，石蜡切片 Human卵巢 GATA-4 核染色 细胞质、细胞膜染色 骨组织 β-catenin 免疫组化2UK红软基地

荧光免疫技术ppt：这是荧光免疫技术ppt，包括了技术原理，实验流程，注意事项，常见问题，时间分辨免疫荧光测定，激光共聚焦扫描显微镜等内容，欢迎点击下载。

自身免疫病ppt：这是自身免疫病ppt，包括了概述，自身免疫，自身免疫性疾病，自身免疫病基本特征，自身免疫病分类，自身免疫病的致病因素，自身免疫病的免疫损伤机制，自身免疫病的治疗原则等内容，欢迎点击下载。

病原生物与免疫学基础ppt：这是病原生物与免疫学基础ppt，包括了关于肝炎病毒，乙型肝炎病毒，生物学特性，致病性，传播途径，HBv变异，乙肝五项指标，乙肝饮食注意等内容，欢迎点击下载。