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核酸杂交技术ppt下载

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核酸杂交技术ppt

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第四章 核酸杂交技术 目 录 第一节 核酸分子杂交的概念 一、核酸探针 二、分子杂交信号检测 第二节 经典的核酸分子杂交技术 一、固相杂交 二、液相杂交 目 录 核酸分子杂交 (molecular hybridization of nucleic acid) 核酸分子杂交:单链的核酸分子在合适的条件下,与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。 核酸分子杂交技术:利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。 核酸分子杂交技术目前应用广泛,是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。 第一节 核酸分子杂交的概念 2、融解温度 (Melting Temperature, Tm) 定义:在DNA热变性时,其A260的升高达最大值一半时的温度。 重点提示 分子杂交:指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理,形成异质双链的过程。利用这一原理,就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针,去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 一、核酸探针 核酸探针指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交,并能由其标记被特异性检测的核酸分子。 1. DNA探针 最常用的核酸探针 2.RNA探针 3.寡核苷酸探针 (二)探针的长度 (三)核酸探针的标记 不同标记类型探针的比较: 2.探针标记方法的选择 二、分子杂交信号检测 (一)放射性标记探针检测 2.液体闪烁计数法 (二)非放射性标记探针的杂交检测 化学发光是指化学反应中释放的能量以光的形式发射出来形成检测信号。 化学发光酶免疫技术中目前常用的酶有碱性磷酸酶及辣根过氧化物酶 发射光线的强度反映了酶的活性,反应了杂化分子的量。 采用发色体检测的最大益处是可同时检测一个以上的杂化分子 每种探针分别用不同的报告基团如生物素、荧光素和地高辛标记并同时与固定在滤膜上的核酸杂交 采用不同的链霉抗生素或抗体-酶和相应底物组合 核酸分子杂交分类 分子杂交技术一般过程 ☆ 探针制备及标记(同位素或非同位素) ☆ 待测核酸样品制备(分离,纯化) ☆ 杂交(液相,固相,原位杂交) ☆ 杂交后处理(去掉非特异杂交分子) ☆ 显示结果(显色,发光,放射自显影) ☆ 结果分析 固相杂交: (一)反向点杂交 (二)Southern印迹杂交 (二)Southern印迹杂交 Southern杂交的应用 Northern杂交应用 二、液相杂交 液相杂交 三、原位杂交 (一)基本操作步骤: 杂交前准备:保持细胞形态结构、保存核酸、增加组织的通透性、减低背景。 杂交:使探针与细胞中的把序列结合。 杂交后处理:盐溶液的漂洗,以减少背景。 显示:根据核酸探针标志物的种类选择相应的检测系统。 (二)原位杂交的应用 1. 细胞遗传学分析 产前诊断 生殖医学中的应用 血液疾病中染色体易位的检测 实体瘤研究 2. 比较基因组杂交 3. 基因图谱绘制 4. 病原学检测 核酸分子杂交技术类型 一、探针的选择 二、探针的标记方法 三、探针的浓度 四、杂交率 五、杂交温度 六、杂交的严谨性 七、杂交反应时间 八、杂交促进剂

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