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分子生物学 第一章 绪论 第一节 分子生物学的定义和研究内容 一、定义 分子生物学是从分子水平研究生命现象及其规律的一门新兴、前沿学科。 它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构、功能及其在信号传递中的作用为研究对象，其发展非常迅速。 分子生物学以其崭新的观点和技术向其他学科的全面渗透，推动了许多学科向分子水平发展。 使细胞生物学、遗传学、发育生物学、神经生物学和生态学由原来的经典学科变成了生命科学的真正前沿科学，形成了一系列交叉学科，如分子遗传学、分子生态学、分子免疫学、分子病毒学、分子病理学、分子肿瘤学和分子药理学等。分子生物学是生命科学的核心前沿。 不同种属生物的表现形式多种多样和千姿百态，但是，生命活动的本质却是高度一致的。例如绝大多数生物遗传取决于DNA；除少数例外，遗传密码在整个生命世界中都是一致的。又如核酸一级结构和蛋白质一级结构的对应关系以及蛋白质的有序合成，也表现出高度一致性。 因此，分子生物学开辟了研究各种不同种属生物的生命现象最基本、最重要的途径。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机遇，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 由于生物化学、生物物理学、细胞生物学、遗传学、应用微生物学及免疫学以及数学、化学、物理学、计算机科学和信息学等专业技术的渗透，分子生物学已发明和创造了一系列新的技术。 例如DNA及RNA的印迹转移、核酸分子杂交、DNA克隆或重组DNA、基因体外扩增、DNA 测序等等，以及研究蛋白质一级结构、二级结构和三维结构与功能的分析技术。 其中重组DNA(recombinant DNA)技术是现代分子生物学技术的核心。 重组DNA技术又称为基因操作(gene manipulation )、分子克隆(molecular cloning)、基因克隆(gene cloning) 或基因工程（gene engineering）等。 这些名词彼此间存在某些微小的差别，在不同情况和不同条件下常常交换使用。 “基因操作”定义为：通过任何方法将细胞外构建的DNA分子(或片段)插入病毒、质粒或其他载体系统，形成遗传物质的重新组合，使它们能够进入宿主细胞内，并能在其中继续扩增。 而“重组DNA 技术”狭义上具“基因操作”相同的含义，但它涉及范围更广泛，甚至泛指分子生物学中与DNA水平研究有关的技术。 因此，分子生物学技术已成为推动生物科学的各个领域向分子水平发展的重要工具或手段，也是服务于人类和社会，推动医药和工、农业发展的强大动力。 二、分子生物学的研究内容 分子生物学的研究内容主要包括以下三个方面。 1、核酸分子生物学： 主要研究核酸的结构及其功能。 2、蛋白质分子生物学： 主要研究蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展缓慢。  3. 细胞信号转导：细胞信号转导的分子生物学主要研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。 第二节 分子生物学发展简史 一、生物遗传物质的发现 早在1868年，Miescher F从脓细胞中分离出细胞核，用稀碱抽提再加入酸，得到了一种含氮和磷特别丰富的物质，当时称其为核素(nuclein)。1872年，他又在鲑鱼精子细胞核中发现了大量的这类物质。由于这类物质都是从细胞核中提取出来的，而且又是酸性，故称其为核酸(nucleic acid)。 二、现代分子生物学的建立 1950年Astbury WT在一次题为“Adventures in molecular biology”讲演中首先使用“分子生物学”这一术语， 用以说明它是研究生物大分子的化学和物理学结构。 1953年Watson JD和Crick FH提出“DNA 双螺旋结构学说”（生理医学奖），是分子生物学创建的里程碑。 该学说启动了分子生物学及重组DNA技术，开创了分子遗传学基本理论的黄金时代。 其主要进展有： 1953年，Watson和Crick《Nature》杂志上发表一篇震动生物学界的论文“脱氧核糖核酸的结构”。 Watson和Crick的DNA双螺旋结构学说已被普遍地视为分子生物学发展的最主要里程碑，也是分子生物学及其技术的重要理论基础。 1956年Kornberg， A.，首先发现DNA聚合酶（生理医学奖）； 1957年，Hoagland MB等分离出tRNA，并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设； 1958年，Meselson M及Stahl FW提出了DNA半保留复制模型； 1958年，Weiss SB及Hurwitz J等发现依赖于DNA的RNA聚合酶； 1961年Hall BD等用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补；这些工作使RNA转录合成的机制得以逐步阐明。 1963年，Holley RW 从酵母中提取丙氨酰转移核糖核酸（tRNA）， 1965年，Holley测定了tRNA核苷酸序列(生理医学奖)。 1968年，Okazaki R（冈崎）等提出了DNA不连续复制模型； 20世纪70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性作了分析研究。这些都逐渐完善了对DNA复制机制的认识。 三、现代分子生物学的深入发展 (一)重组DNA技术的发明 1．基因克隆工具酶的发现： 1970年，Smith HO在微生物中发现一组目前称之为限制性核酸内切酶的酶类，简称限制酶(restriction enzyme)。（生理医学奖） Temin等从肉瘤病毒(一种逆转录病毒)中发现了一种逆转录酶(reverse transcriptase)（生理医学奖） 2．DNA片段的体外连接：1972年，Berg P和Jackson DA等首次将两个不同生物体来源的DNA片段，在DNA连接酶的作用下进行连接(或重组)，产生了第一个重组DNA分子。 3．质粒的构建：1973年，Cohen S 构建了第一个可用于 DNA 分子克隆的载体——质粒（plasmid）。 4．核酸杂交技术：1969年，Pardue ML等首先建立了细胞原位杂交技术。1975 年，Southern EM发明一种印迹杂交技术，被称为 Southern 印迹或Southern转移技术。 5．DNA序列分析技术：1977年，剑桥大学Sanger F等创建了双脱氧末端终止法测定DNA序列，与此同时，美国Maxam I和Gilbert W发明了化学裂解法或部分降解法测定DNA序列（化学奖）。 6．聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR) ： 1985年，Mullis K首创聚合酶链式反应 (PCR)技术（化学奖）。该技术在体外模拟细胞内DNA的复制过程，进行体外“基因扩增”。 (二) 分子生物学技术的应用与发展 由于分子生物学的广泛渗透和应用，反过来又推动了重组DNA技术和分子生物学本身的发展。有关这方面的研究进展事例不胜枚举。现仅就具有重大历史意义、影响广泛深远的主要事件简述如下。 1．癌基因的发现：1975年，Bishop JM和Vermus HE在Rous肉瘤病毒(一种逆转录病毒)中首次发现了第一个癌基因－src。同时证明src基因不是Rous肉瘤病毒所固有、而是来自宿主细胞基因组，在所有小鸡细胞中都有其同源副本。 2．基因诊断：1976年，Kan YW应用分子杂交技术，用cDNA探针进行溶液杂交，检测α-珠蛋白基因有无缺失，首次成功地进行了一例α珠蛋白合成障碍性贫血（又称为α-地贫）纯合子胎儿(胎儿水肿)的产前诊断。这也是首例单基因遗传疾病的基因诊断。 3．基因组文库的建立： 1978年，Smithies O等建立了第一个人类基因组文库(genomic library)。 4．基因工程生产人胰岛素： 1979年，Goeddel DV及其同事详细报道了他们成功地用化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中进行了表达。随后Eli Lilly公司在1982年获准销售基因工程生产的胰岛素。 5．转基因动物： 1981年，Palmiter R和Brinster R利用基因转移技术成功地建立第一个转基因小鼠，转基因动物模型的建立，为研究基因功能及遗传病的基因治疗提供了活体模型。 6. 人类基因治疗研究： 1990年4月，美国NIH的Blaese RM和Anderson WF 等首次将腺苷脱氨酶(ADA)基因导入至一位患严重复合免疫缺陷症(SCID)的4岁小孩体内，并取得一定疗效，开创了人类基因治疗（human gene therapy）的先河，并为20世纪90 年代以来基因治疗研究蓬勃开展奠定了基础。 7．基因工程抗体技术的建立和发展： 人们利用细胞工程技术研制出多种单克隆抗体，为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。 8．DNA芯片（基因芯片、生物芯片）技术： 是指将大量探针分子固定于固体支持物上，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。 （三）基因组研究的进展 基因组（genome）是指一个物种遗传信息的总和。 2001年2月11日，参加人类基因组计划的六国科学家、美国塞莱拉遗传信息公司、美国《科学》杂志和英国《自然》杂志联合宣布，继科学家于2000年绘制成功人类基因组工作框架图之后，又绘制出了更加准确、清晰、完整的人类基因组图谱，对人类基因组的面貌有了新的发现。 人类基因数量远比预计的少，人类基因数量仅有2.5～3万个左右，比以前估计的8万至10万个要少得多。 通过进一步研究还发现，男女可能存在巨大遗传差异，男性染色体减数分裂的突变率是女性的两倍。并找到了很多与遗传病有关的基因，包括乳腺癌、遗传性耳聋、中风、癫痫症、糖尿病和各种骨骼异常的基因。 (四)基因表达调控机制的研究 1961年，Jacob F和Monod J最早提出操纵子学说（生理医学），打开了人类认识基因表达调控的窗口。 从80年代开始，人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式作用因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是真核基因表达调控的根本所在。 1981年，Altman S和 Cech TR同时发现了具有催化自我剪接活性的RNA，称之为ribozyme(核酶)（化学奖），参与基因表达的调节。 （五）小分子RNA研究进展 1993年，Lee RC等发现线虫(C.elegans) lin-4基因编码的小分子RNA，其长度为22～61个核苷酸——反义RNA。 反义RNA能与lin-14 mRNA的3ˊ非翻译区（untranslated region，UTR）反义互补结合，阻断lin-14的翻译，降低线虫早期发育阶段lin-14蛋白的水平。 小干扰性RNA (small interfering RNA，siRNA)系21～25个碱基对的短双链RNA，是长双链RNA (dsRNA)被细胞内Dicer切割而成。 siRNA能诱发细胞内基因沉默，使那些与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制了该基因的表达，这一现象称为RNA干扰（RNAi）。 （六）细胞信号转导机制研究 1957年，Sutherland EW发现了cAMP， 1965年又提出第二信使学说，这是人们认识受体介导的细胞信号转导的第一个里程碑。 1977年，Ross EM等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，G蛋白参与偶联信号转导。 从1957年到2000年从事分子生物学研究的科学家共获得了31项诺贝尔奖。 第三节 分子生物学与相关学科的关系 一、分子生物学与生物化学 生物化学与分子生物学关系最为密切。两者在我国教育部和科技部颁布的二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”， 两者并重。分子生物学虽然主要起源于生物化学，但它又不同于生物化学。 生物化学主要是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的化学结构、转化和新陈代谢。 分子生物学则着重阐明生命物质（核酸与蛋白质）的结构与功能的关系、细胞内信号转导途经和基因表达调控的机制。 二、细胞生物学与分子生物学 细胞生物学与分子生物学关系十分密切。 传统上，细胞生物学主要是利用光学显微镜和电子显微镜研究细胞和亚细胞器的形态、结构与功能。细胞是由许多分子组成的复杂体系，探讨组成细胞的生物大分子结构与功能，比单纯观察细胞形态更能深入了解细胞的结构与功能，因此，现代细胞生物学越来越多地应用分子生物学的理论和方法。 分子生物学则是从生物大分子的结构入手，主要研究细胞整体反应的分子机制。这反映了分子生物学和细胞生物学的交叉与融合，因此，产生了细胞分子生物学。 三、分子生物学与遗传学 遗传学是研究生物体遗传和变异的科学。由于分子生物学的兴起和发展，现在已经确认生物遗传信息携带者——基因就是DNA分子中的一个片段。 随着分子生物学向遗传学深入渗透，经典遗传学已进入分子水平，因而诞生了分子遗传学。 分子遗传学是分子生物学和遗传学相互交叉和渗透的结果。 分子遗传学和分子生物学的研究界线越来越模糊，但并不能说分子遗传学就等于分子生物学， 因为分子生物学研究范围更广泛，几乎包括生命科学各领域的分子水平研究。 四、分子生物学与生物技术 根据美国生物技术产业组织的定义：生物技术(biotechnology)是指“利用细胞和分子过程来解决问题或制造产品的技术”。 现代生物技术主要包括两个方面：基因（核酸）工程和蛋白质（酶）工程。 这两方面的生物技术又统称为分子生物学工程。 练习题（1） 一、名词解释 1、基因表达； 2、操纵子 3、反式作用因子； 4、启动子 5、Southern印迹杂交； 6、转录图 7、生物信息学； 8、转化 9、α-互补作用 ； 10、锌指结构 二、选择题 1、 原核生物基因表达的特点 A 只有一种RNA聚合酶； B 基因以操纵子为基本单位进行表达； C 转录和翻译过程是偶联进行的； D 转录产物需要经过加工修饰。 2、 DNA序列分析的主要应用有 A 分析基因的精细结构； B 用于基因诊断和变异分析； C 由基因结构预测蛋白质功能； D 用于基因工程和蛋白质工程相关分析。 3、 提高表达蛋白的稳定性的措施有 A 让外源基因和宿主基因一起表达，形成融合蛋白； B 用酶消化载体； C 采用蛋白酶缺陷的突变菌株； D 表达分泌蛋白 三、 问答题 1、简述PCR定点诱变法的原理与步骤 2、简述DNA芯片技术的应用 第二章 基 因 与 基 因 组 第一节 基 因 一、基因概念的起源 1865年，现代遗传学的奠基人Mendel通过著名的豌豆杂交实验提出遗传因子学说。 1909年Johannsen将遗传因子改称为基因，并提出基因型和表型的概念。 基因型(genotype)是逐代传递下去的成对因子的集合，因子中一个来源于父本，另一个来源于母本。 表型(phenotype)是指一些容易区分的个体特征的集合。 二、基因的化学本质 1944年，美国的生物化学家Oswald Avery利用灭活的致病肺炎球菌提取DNA，与非致病肺炎球菌混合培养，使后者转化为具有致病性的细菌，从而证实遗传基因的本质是DNA。 1952年，Alfred Hershey和Martha Chase利用病毒证实了DNA是遗传物质的携带者。 三、基因概念的发展与现代理解 Beadle和Tatum在1946年提出了“一个基因一种酶”的理论，并因此获得1958年的诺贝尔生理学和医学奖。 但是，对于具有多个亚单位的蛋白质来说，“一个基因一种酶”的假说不够完善。因此，人们提出了“一个基因，一条多肽链”的概念。 然而，在DNA分子中，除了编码蛋白质的基因外，还有编码RNA的基因，如编码tRNA 、rRNA 和snRNA的基因。因此，“一个基因，一条多肽链”的理论也不够完善。 现代基因的定义为： 基因是核酸中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息以及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 简单地说， 基因——指导合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部DNA序列。 四、基因的结构 从分子生物学的角度来说，基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列。 在基因中用于编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因（structure gene）， 结构基因两侧的侧翼序列是不编码RNA或蛋白质的DNA片段，但含有基因的调控序列（图2-1）。 图2-1 基因结构图 （一） 结构基因 大多数结构基因能通过信使RNA（messenger RNA，mRNA）进一步编码某种多肽或蛋白质，但有少数结构基因仅仅编码一些具有特定功能的RNA，如转运RNA（transfer RNA，tRNA），核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和其他小分子RNA。 结构基因的DNA双链都有作为模板链的可能。 携带生物信息（RNA序列信息）的那一条DNA链称为信息链或有意义链（sense strand）。 由结构基因转录所得的RNA分子的核苷酸序列与其信息链的核苷酸序列一致，只是以U 取代了T。 5`-ACGTTCCGA-3` 3`-TGCAAGGCT-5` DNA ↓ 5`-ACGUUCCGA-3` RNA 对于编码蛋白质的基因来说，信息链又称为编码链。 与信息链互补的DNA单链即为转录模板链（templates strand） 也称反意义链（antisense strand）。可以用来合成一条与模板DNA碱基互补的RNA链。 原核生物的结构基因是连续的，其RNA合成后不需要经过剪接加工。 大多数真核生物基因则在编码区（coding region）内含有非编码的插入序列，因此被称为断裂基因（interrupted gene） 断裂基因——被非编码序列隔断了的不连续的结构基因。其中编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron）， 内含子和外显子一起转录，形成mRNA前体（precursor），但是在加工过程中被剪切掉，故内含子不存在于成熟的mRNA序列中。经过剪接，由全部外显子连接而成的mRNA参与指导多肽链的合成。 在真核生物基因的外显子与内含子接头处都有一段高度保守的一致序列（consensus sequence）。即内含子5ˊ端大多数是以GT开始，3ˊ端大多数是以AG结束，这称为GT-AG法则。可以用它作为真核基因中RNA剪接的识别信号。 (二) 非结构基因——参与转录调控的顺式作用元件 这类调控元件是与结构基因串联、具有调控转录作用的特定DNA序列。由于他们和特定功能的基因连锁在一起，因此称为顺式作用元件（cis-acting element )。 包括：启动子、增强子、沉默子、终止子等。 1. 启动子和上游启动子元件 （1）启动子 启动子（promoter）是指能被RNA聚合酶特异性识别和结合，并能启动转录过程的DNA序列。 启动子具有方向性，位于结构基因转录起始点的上游，本身并不被转录。 原核生物基因的启动子序列具有较高的同源性 。 真核基因启动子差别很大，但，几乎所有已发现的真核生物基因的启动子都有TATA盒（TATA box），其核心序列是TATA（A/T）A（A/T），位于转录起始点上游-25 bp左右处，TATA盒与一种被称为TATA因子（转录因子）结合后，成为完整的启动子，精确地决定RNA合成的起始位点。 启动子的应用：一个好的启动子具有重要应用价值。 （2）上游启动子元件 上游启动子元件（upstream promoter elements）是TATA盒上游的一些特定的DNA序列。 反式作用因子可与这些元件结合，通过调节TATA因子与TATA盒的结合、RNA 聚合酶与启动子结合及转录起始复合物的形成来调控基因的转录效率。 上游启动子元件包括CAAT盒、CACA盒及GC盒等。 CAAT盒含有5ˊ-GGNCAATCT-3ˊ核心序列。 GC盒含有5ˊ-CCGCC-3ˊ核心序列，两者位于-70 bp和-120 bp之间，CACA盒的核心序列为GCCACACCC，位于上游-80 bp～-90 bp处。 2．反应元件 一些受体被细胞外信息分子激活后，能与特异的DNA序列结合。被结合的DNA序列能调控基因的表达。这种能介导基因对细胞外的信号产生反应的DNA序列称为反应元件（response elements）。 能与反应元件结合的信息分子受体叫做反式作用因子，如糖皮质激素受体。 糖皮质激素→～受体（蛋白质）活化＋特异的DNA序列（反应元件）→调控基因表达。 反应元件都具有较短的保守序列。 这些元件通常位于启动子附近和增强子内。 糖皮质激素反应元件在增强子内。 如热休克反应元件一般在启动子附近。 3．增强子 增强子（enhancer）是一段能增强邻近基因转录的DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件。反式作用因子与这些元件结合后能够增强邻近基因的转录。 增强子的作用： 主要通过改变DNA模板的螺旋结构、为DNA模板提供特定的局部微环境；或为RNA聚合酶和反式作用因子提供一种结构，以帮助它们与某些顺式元件相联系等方式而发挥调节作用。 增强子在不同的基因中，其位置也不同。 增强子的作用无方向性和基因特异性，也不受基因之间距离远近的影响。 增强子是一种正调控序列。 增强子的应用： 4、衰减子（沉默子） 1986年Maniatis等研究干扰素-β（IFN-β）基因转录时发现了负调控序列。他们把这种对基因转录起负调控作用的DNA序列称为衰减子，或沉默子（silencer）。 在真核细胞中，沉默子对成簇基因的选择性表达起重要作用。 4．加尾信号 在结构基因的最后一个外显子中有一个保守的AATAAA序列。这个序列对于mRNA转录终止和加poly(A)尾是必不可少的。 AATAAA序列及其下游的一段GT丰富区或T丰富区共同构成poly(A)加尾信号。 poly(A)加尾信号——由AATAAA序列及其下游的一段GT丰富区或T丰富区共同构成的、能终止转录和添加多聚A尾的DNA序列。 mRNA转录到此部位后，会产生AAUAAA和GU（或U）丰富区。RNA转录延长因子可以识别这种结构并与之结合，然后在AAUAAA下游10~30个碱基的部位切断RNA，并加上poly(A)尾。 第二节 基因组 一个物种的单倍体染色体数目及其所包含的全部遗传物质，称为该物种的基因组(genome)。 换句话说，基因组是细胞或生物体中一套完整单倍体所含遗传物质的总称。 人类基因组包括核基因组和线粒体基因组。 进化程度越高的生物体其基因组越复杂。 一、病毒基因组的结构和功能 病毒(virus)是一种具有比较原始的生命形态和生命特征的非细胞生物。完整的病毒颗粒包括衣壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA， （一）病毒基因组的结构特点 1．不同病毒基因组大小相差较大 与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小，但是不同的病毒之间其基因组相差甚大。如乙肝病毒（HBV）DNA只有3.2 kb，所含信息量也较小，只能编码4种蛋白质，而痘病毒的基因组有300 kb之大，可以编码几百种蛋白质。 2. 不同病毒的基因组可以是不同结构的核酸 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成。每种病毒颗粒中只含有一种核酸，DNA或RNA， DNA或RNA可以是单链的，也可以是双链的，可以是闭环分子，也可以是线性分子。 3．单倍体基因组 所有病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。但逆转录病毒基因组例外，它有两个拷贝（其基因组由两个相同的线状正链RNA发展组成，称为二倍体RNA基因组）。 4．病毒基因组有连续的也有不连续的 。 DNA病毒基因组均由连续的DNA分子组成； 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成，但有些是由不连续的核糖核酸链组成，形成所谓分段基因组（segmented genome）。如流感病毒的基因组有8个节段。 5．基因有连续的和间断的： 感染细菌的病毒（噬菌体）基因组与细菌基因组结构特征相似，基因是连续的；而感染真核细胞的病毒基因组与真核生物基因组结构特征相似，有的基因具有内含子，基因是间断的。 有些真核病毒的一部分，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因却是外显子。如SV40的早期基因即大T和小t抗原的基因都是从5 146位开始，沿逆时针方向进行，大T抗原基因进行到 2 676位终止，而小t抗原进行到4 624位终止。但是，从4 900到4 555之间有一段346 bp的片段是大T抗原基因的内含子，而该内含子是小t抗原的编码基因（图2-2） 。 6．病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 病毒基因组的编码序列大于90%，只有很小的一部分不编码蛋白质。 7．相关基因丛集 病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元。 8．基因重叠 重叠基因（overlapping gene）即同一段DNA片段能够以两种或两种以上的阅读方式进行阅读，因而可编码2种或2种以上多肽。 (二)特殊病毒基因组介绍 1．乙型肝炎病毒： 2．逆转录病毒 逆转录病毒属于RNA病毒。所有逆转录病毒的共同特点是能够携带或编码合成逆转录酶（RT）。与其它RNA病毒复制不同的是，当病毒感染细胞后，首先以自身的基因组RNA为模板，在RT催化下合成DNA中间体，即前病毒DNA（provirus DNA）。该DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA上，并且能够作为细胞基因组的一部分，随细胞基因组复制和细胞分裂而传递下去；在宿主RNA聚合酶的作用下，原病毒DNA可以重新转录形成子代病毒RNA。 二、原核生物基因组 （一）原核生物基因组结构与功能的特点 1．基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。 2．基因组中只有1个复制起点。 3．具有操纵子结构。 操纵子（operon）是指数个功能相关的结构基因串联在一起，构成信息区（多顺反子），连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）及其下游的转录终止信号构成的基因表达单位。 ——由多顺反子及其调控序列构成的基因表达单位。 4．结构基因无重叠现象。 5．基因序列是连续的，无内含子结构，转录后不需要剪接。 6．编码区和非编码区（主要是调控序列）在基因组中约各占50%。 7．基因组多为单拷贝基因，重复基因很少。 8．具有编码同功酶的基因（isogene）。 9．细菌基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。 10．在DNA分子中具有多种功能识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录启动区和终止区。 (二) 染色体外的遗传物质——质粒 质粒（plasmid） 是独立于许多细菌及某些真核细胞（如：酵母等）染色体外的共价闭合环状DNA分子（cccDNA），是能够独立复制的最小遗传单位。 尽管质粒不是细菌生长、繁殖所必需的物质，但它所携带的遗传信息能赋予细菌特定的遗传性状，如耐药性质粒（R质粒）带有耐药基因，可以使宿主菌获得耐受相应抗生素的能力。 用途： （三）转座（位）因子 转座因子（元件）（transposable element） 即可移动的基因成分，是指能够在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。 细菌的转位因子（元件）包括插入序列、转座子及可转座的噬菌体。 （1）插入序列（insertion sequence，IS） IS是一类较小的没有表型效应的转位因子，长度约700～2 000 bp，由一个转位酶基因及两侧的反向重复序列（inverted repeat sequence，IR）组成。 （2）转座子（transposon，Tn） Tn是一类较大的可移动成分，除转座基因外，至少含有一个与转座无关并决定宿主菌遗传性状的其它基因，如抗药基因。 （3）可转座的噬菌体（transposable phage） 是一类具转座功能的溶源性噬菌体，包括Mu和D108等。 Mu噬菌体是大肠杆菌的一种温和致突变噬菌体，是原核生物中第一个被阐明的可移动因子。 噬菌体感染细菌后，通过整合作用，可插入细菌结构基因内，引起突变。 2. 转位作用的机理 3. 转位的遗传效应 （1）转位因子插入到结构基因中可使基因序列发生改变，造成基因插入失活或功能改变；如果插入到非编码区（调控区），可使下游基因不能转录；转位因子的插入还可能引起基因突变、缺失和基因重排。 （2）由于转位因子的纵向转位插入，可产生新基因，如R质粒的转位因子转位到染色体上，在该部位出现抗药性基因，从而使抗药性在菌群中得以传播； 练习题（2） 名词解释 1、 基因表达调控 2、多顺反子 3、DNA多态性 4、增强子 5、PCR 6、基因组作图 7、蛋白质工程 8、转导 9、 cDNA文库 10、 DNA指纹图谱 二、选择题 1、真核生物基因表达的特点有（ ） A 基因表达具有时间性和空间性； B 转录和翻译过程分开进行； C 初级转录产物要经过加工修饰； D 也有超基因式操纵子结构。 2、 提高PCR扩增的特异性的途径和方法有（ ） A 提高退火温度、缩短退火和延伸时间； B 增加dNTP浓度 C 降低引物和酶的浓度； D 提高引物设计的特异性。 3、引物设计原则有（ ） A 特异引物长度控制在20～30 bp； B G + C含量控制在40-60%； C 引物自身和引物之间没有互补序列； D 引物3′不能进行任何修饰。 三、问答题 简述基因克隆的主要步骤 简述蓝-白筛选的原理与方法 四、 计算题 现有OD260为0.5，碱基数为25的干粉DNA引物。请将它配制成浓度为10 pmol / µl的应用液。如果50 µl PCR反应体系需要40 pmol 引物，请问25 µl 反应体系需要这种浓度的应用液多少微升？ty2红软基地

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