rnai和sirna转染浓度介绍PPT下载

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SiRNA与RNAi实验技术 RNAi的研究史 1990年，Jorgenson 在矮牵牛花中发现转基因沉默。 1995年，Guo 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-I基因的表达。 1998年，Fire 和 Mello 研究证实在正义RNA阻断基因表达实验中，真正起作用的是双链RNA，于是提出了RNAi。（2006年诺贝尔生理学或医学奖） 2001年，Elbashir 等在《Nature》上首次报道通过21nt的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。 RNAi的研究史 RNAi的发现费尔和梅罗以前一直从事线虫基因表达的调控研究，他们将一种编码肌肉蛋白的mRNA注射到线虫体内以改变线虫的行为。 他们使用的携带遗传密码的mRNA有两种:一种是编码的mRNA，称为正义RNA，另一种RNA可以与上述的mRNA碱基互补相结合， 称为反义RNA。 无论是那一种RNA都不能够引起预期的表型作用，但是当他们把这两种RNA一起注射，观察到线虫表现出特有的颤搐性运动，而相似的运动只发生在那些完全缺失这种肌肉蛋白功能基因的线虫身上，这是什么原因? RNAi的发现是否特异的双链RNA分子可以使与其具有相同编码的基因沉寂或者说使它的活性受到抑制? 为了检测这个假设，他们向线虫体内注射了一些含有各种蛋白质基因编码的双链RNA分子，无一例外，只要注射了含有编码某种特异蛋白质基因的双链RNA分子，这种蛋白就不会再产生了。 费尔和梅罗把这个现象称作RNA干扰(RNAinterference， RNAi)，认为这是一个催化过程，即微量的双链RNA足可以达到抑制基因的效应。 RNAi的发现费尔和梅罗的研究结果发表在1998年2月19日出版的《自然》杂志上。他们的发现使得很多以前实验观察中的困惑和矛盾的结果得到了解释并且揭示了遗传信息流的一个基本原理，同时又开辟了一个新的研究领域。 Fire A， Xu SQ， Montgomery MK， etal. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature， 1998，391:806-811. 什么是siRNA和RNAi？ siRNA（small interfering RNA），是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。 这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了，双链RNA对基因表达的阻断作用就被称为RNA干预（RNA interference， RNAi ）。 RNAi的作用机制 RNAi的特征 1. RNAi属于转录后水平的基因沉默机制，迄今为止的研究认为RNAi对染色体DNA序列的复制和转录过程不产生任何影响； 2. 具有高度的序列特异性，最近将人工合成的siRNAs，转入宿主细胞的实验表明，即使siRNAs中只有一个碱基与靶序列错配， 也会使干涉效应大大减弱； 3. 具有抑制基因表达的高效性，可以引起该基因缺失突变的表型；而且远远少于内源mRNA数量的dsRNA就可以实现完全的抑制效应，即其发生过程中存在着正反馈的信号放大效应； 4. RNAi的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持，而且在某些生物中(比如线虫)具有遗传性。 RNAi技术的应用 基因功能研究 （Gene function）基因治疗 （Gene therapy） ---病毒感染引起的疾病（Diseases by virus）： 如艾滋病，肝炎等 ---肿瘤（Tumor） ---遗传性疾病（Hereditary disease）新药开发（Development of new drugs） RNAi国内外研究现状和发展趋势 RNAi最初的研究多局限于植物、线虫和果蝇等的研究。对哺乳动物的研究则是在最近几年，对其发生机制有了初步了解后才开始的。RNAi技术在实验动物体内的研究目前在国内还鲜有报道，在国外也不多见。目前的研究多局限于细胞水平，如何将siRNA安全有效地导入动物体内，是制约RNAi技术在实验动物体内应用的瓶颈之一。但RNAi诱人的应用前景仍吸引着许多科学家、研究小组、实验室以及国际知名的生物公司投入到这放方面的研究。如何进行RNAi实验的设计？ 设计siRNA序列 siRNA的获得 siRNA的转染 RNAi的效果分析 设计siRNA序列 1、 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选 http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 设计siRNA序列 2、siRNA序列的选取原则 (1) 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3‘端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 (2) 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLASTwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 (3) 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。设计siRNA序列 3、阴性对照 一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。 设计siRNA序列 4、目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到 http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49 http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/Browse Catalog.jsp?Category=Published siRNA的获得 目前为止较为常用的方法有通过化学合成、体外转录、长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer， E. coli， RNase III)、体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。 siRNA的获得 1、体外制备 2、体内表达 siRNA的获得--体外制备 a、化学合成法 许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量 siRNA进行研究。 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。 siRNA的获得--体外制备 b、体外转录 以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。 siRNA的获得--体外制备 c、用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。 siRNA的获得--体内表达 a、 siRNA表达载体 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA， shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间。 最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。 siRNA的获得--体内表达 b、siRNA表达框架 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。 最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）。 siRNA的获得—方法小结 siRNA的转染 1、磷酸钙共沉淀 将氯化钙，RNA（或DNA）和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含RNA（或DNA）且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-RNA或DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 siRNA的转染 2、电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。 siRNA的转染 3、DEAE-葡聚糖和聚凝胺 带正电的二乙胺基乙基纤维素（DEAE）-葡聚糖或聚凝胺多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透压差将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 siRNA的转染 4、机械法 转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 siRNA的转染 5、阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。 siRNA的转染为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1、纯化siRNA 2、避免RNA酶污染 3、健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 4、避免使用抗生素 5、选择合适的转染试剂 6、通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 7、通过标记siRNA来优化实验 RNAi的效果分析 RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用 RT-PCR、荧光定量PCR或Northern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可通过Western杂交，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。 siRNA实验成功的要点 对每个基因设计并检查两到四个siRNA序列选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 避免RNA酶污染健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性避免使用抗生素选择好的转染试剂转染siRNA 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件通过阴性对照siRNA排除非特异行影响通过标记siRNA来优化实验 RNA 操作时的注意事项与实验技巧 1、操作注意事项 1）如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。 2）操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。 3）尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。 4）配制溶液用的酒精、异丙醇、Trizol等应采用未开封的新品。 5）所有玻璃制品都必须在200烘烤4小时。所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌，也可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。 RNA 操作时的注意事项与实验技巧 2、样本保存的注意事项 传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。 目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂，如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定样本中RNA的作用。无需液氮或干冰，方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存。 RNA 操作时的注意事项与实验技巧 3、RNA的定量与纯度 RNA通常用分光光度计定量，测量在260 nm处的吸收值（A260）。通常分光光度计A260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的，因此RNA提取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计测量。A260为1相当于RNA的浓度为40μg/ml。 为了检测RNA的纯度，可以测量A260与A280的比值，通常纯RNA的A260/A280为1.8-2.0。 问题与猜想 A、 问题 在siRNA与RNAi的研究中，仍有许多的问题： 蛋白是如何与siRNA组合在一起的，如何成为活性形式？对靶RNA的剪切作用，其相关的分子机制如何，是需要特异的蛋白来剪切靶RNA，还是引导的siRNA本身即有剪切作用等。哺乳动物与人的RNAi机制是否与简单的真核生物类似，RNAi的进化地位如何等。 问题与猜想 B、 猜想 1、 疾病治疗：主要的问题还是转运系统的选择，如何找到一种高效而低毒的用于人体的转运载体是摆在所有RNAi应用面前的最大敌人。依靠免疫系统寻找转运载体可能成为途径之一，而免疫系统中本身可能也有RNAi参与。细胞中是否普遍存在RNAi或进行RNAi的潜力呢？细胞的凋亡机制可能也与RNAi有关。 病毒的蛋白质复制途径可能有多种，RNAi是否能像人们期待的那么有效？ 问题与猜想 2、如果siRNA可以永久地关闭或者删除DNA片断，而不仅仅 是短期的抑制它。那么动物细胞全能性受抑制的程度可能远远高于过去人们所想象的。干细胞的可塑性可能是由于可以产生特异的siRNA或其前体。干细胞通过细胞内的RNAi机制在发育过程中关闭或开放基因的表达，从而指导着细胞的定向分化。其中的siRNA有可能来自DNA的内含子。 3、在研究基因时，可通过短期的抑制干细胞某个基因的表达来得知其功能。OHX红软基地