质粒dna的提取与酶切PPT下载

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实验背景 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒 和 严紧型质粒 松弛型质粒：松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。质粒的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 质粒特点 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。 分离质粒DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱裂解法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高，提取的质粒DNA可用于酶切，连接与转化。 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各个主要试剂的作用。实验原理质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 实验原理分析 试剂 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA 实验步骤 1、将含有pQE30质粒的大肠杆菌TG1 10μL接种到10ml含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养液中，37℃振摇过夜 2、取1.5ml菌液，转入离心管中，10000r/min离心1min，吸净上清液 3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀 实验步骤 4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓颠倒离心管5次，以混合内容物，禁止剧烈震荡，冰浴2min 5、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后冰浴5min 6、用微量台式高速离心机12000r/min离心5min，将上清液转入另一离心管中 实验步骤 7、加等体积酚—氯仿，剧烈震荡1min后，12000r/min离心5min，将上层液转入另一离心管中 8、加等体积氯仿—异戊醇，剧烈震荡10s后，12000r/min离心1min，将上层液转入另一离心管中 9、室温下加入两倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温下静置5min 实验步骤 10、12000r/min离心10min，去上清液，加1ml70%乙醇，短暂振摇，然后再12000r/min离心5min 11、除去所有上清液，待残余乙醇挥发干净后，加30μLTE缓冲液（PH=8.0）溶解沉淀，再加1μlRNaseA（1mg/ml），37℃保温15min，取出后即可用酶切分析或置于-20℃保存备用 。思考题１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用分别是什么？加入上述溶液时要注意哪些问题？２．实验中加入酚、无水乙醇和RNaseA的作用分别是什么？ 注意事项溶液1的作用：分散细胞，蟄合金属离子使金属酶失活。注意：加入溶液1后，一定要彻底悬浮细菌沉淀，否则所提质粒DNA的纯度及得率会大大降低。注意事项溶液2的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂，核酸和蛋白质变性。注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打乱基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组片段。此时菌液应变得清凉粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。注意事项溶液3的作用：使PH值恢复至中性，质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀。注意：溶液3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。dkm红软基地

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